由于石墨烯基材料（GRMs）的生物相容性和高運載能力，它可能代表了一種理想的大腦輸送系統。石墨烯基材料到達大腦的能力主要是在體內進行的調查，并突出了一些爭議。在此，我們采用了兩種復雜性不斷增加的體外BBB模型來研究與氧化石墨烯（GO）和幾層石墨烯（FLG）的仿生相互作用：二維小鼠Transwell模型，然后是三維人類多細胞集合體，以模仿體內結構的復雜性和細胞間的串擾。我們開發了特定的方法來評估GO和FLG在無標簽方式下的轉移，以及一個適用于任何納米材料的平臺。總的來說，我們的結果顯示這兩種GRM具有良好的生物相容性，不影響屏障的完整性和功能。充分分散的GO和FLG亞群被內皮細胞積極吸收；然而，這種轉移被認為是一種罕見的事件。
圖1. 接觸GRM后BBB特性的描述。暴露于10μg/mL的GO（A）或FLG（B）48小時后，在玻璃蓋玻片上播種的bEnd.3單層細胞中，ZO-1（綠色）的免疫熒光染色的代表性共聚焦圖像。Hoechst染料用于核子的可視化（藍色）。GRM顆粒在光反射模式（LR）模式下是可見的（粉紅色）。BF表示亮場圖像。比例尺。50μm。(C）暴露于10μg/mL的GO和FLG 6、24和48小時后的TEER值。對于每個時間點，其值都被歸一化，并以平均值±SD表示（n=9個獨立的制備）。(D）暴露于10μg/mL的GO和FLG 6和48小時后，FD4的表觀滲透性（Papp，%）。沒有細胞的Transwell（空）的Papp表示為100%，數值相應地被歸一化。數值表示為平均值±SEM（n = 3）。
圖2. GO和FLG的攝取動力學和內化途徑。代表性的TEM顯微照片顯示GO（A）和FLG（B）薄片在bEnd.3細胞中的細胞內化。在左邊的低倍顯微鏡照片中，N表示細胞核。(C) GO和FLG(10 μg/mL)在bEnd.3細胞單層中暴露于這些材料2、6、24和48小時的吸收動力學。數據表示為平均值±SEM（n = 3個獨立制備）。*p < 0.05, ***p < 0.001, 非配對學生t檢驗。在沒有或存在不同的內吞作用抑制劑（CPZ、CYTD、NOC）的情況下，暴露2小時后細胞對GO（D）和FLG（E）（10 μg/mL）的吸收。平均數±SEM，n = 3。** p < 0.01, ***p < 0.001, 單向方差分析/Tukey檢驗。所有攝取量的測量是由SSC在流式細胞儀中完成的，并在未處理的細胞（CTRL）上進行歸一化處理。
圖3. GO和FLG在bEnd.3細胞單層上的轉位。(A) 兩種GRM片穿過二維BBB模型的過程示意圖。(B）用10μg/mL的GO或FLG培養24小時的bEnd.3細胞的代表性共聚焦XY平面和Z投影。細胞用Hoechst（細胞核，藍色）和ZO-1抗體（綠色）進行染色。比例尺。50μm。(C）去除細胞后的Transwell膜（BF）的代表Z投影圖。一些GO和FLG的片狀物在膜上易位，可見粉紅色（LR模式）。比例尺：20μm。(D）基底層餾分的分析：基底層餾分中發現的石墨烯團塊的代表性拉曼光譜和相應的樣品區（插圖中的BF圖像）。
圖4. 與線性彎曲、Hencky解和FvK模型相比，GPH膜相對于徑向位置的偏轉。（a） 254 nm的膜厚加壓至ΔP=21 kPa。（b） 夾緊膜邊緣周圍（a）的放大。（c） 65 nm的厚度加壓至ΔP=68 kPa。（d） 夾緊膜邊緣周圍（b）的放大。（e） 加壓至ΔP=116 kPa的45 nm厚度。（f） 夾緊膜邊緣周圍（e）的放大。
圖5. GO和FLG與BBB的三維人類多細胞集合體模型的相互作用：流式細胞儀和TEM分析。(A) 預染hMCA形成和解離的工作流程示意圖。(B) NHA、hBPV和hCMEC/D3的三個獨立培養物在流式細胞儀上一起運行時，SSC與FSC（前向散射）的點圖和細胞追蹤器紅色（星形膠質細胞）和綠色（周細胞）的門控。(C) 解離的hMCA的SSC與FSC和細胞追蹤器紅色（星形膠質細胞）和綠色（周細胞）的點陣圖。(D) 在流式細胞儀上獨立運行的三種細胞類型（NHA、hBPV和hCMEC/D3）的平均SSC定量。(E) 三個細胞型（NHA、hBPV和hCMEC/D3）在hMCA解離后的平均SSC定量。數據表示為平均值±SEM（n = 2）。(F) 不同細胞型對GO和FLG的吸收，以SSC的倍數比對照細胞增加表示。數據表示為平均值±SEM（n = 3）。暴露于GO（G）和FLG（H）的hMCA的TEM顯微照片，顯示了周邊細胞層的罕見材料內化。
相關研究成果由意大利理工學院Valentina Castagnola和Fabio Benfenati 等人2023年發表在Nano Letters (https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c00377)上。原文：Interactions of Graphene Oxide and Few-Layer Graphene with the Blood–Brain Barrier。
轉自《石墨烯研究》公眾號
